肝细胞癌(HCC)严重威胁着人类健康。索拉非尼是一种被批准为治疗晚期HCC的一线系统性靶向药物，但治疗耐药性降低了其临床疗效。自噬在HCC中也发挥促进肿瘤发生、维持肿瘤生长、增强转移的作用。靶向自噬相关基因的miRNAs的失调可能导致索拉非尼耐药，促进HCC细胞的生长。

　　1.miR-541的下调与肝癌患者短生存期和高复发率相关

　　首先查阅miR-541在HCC患者中的预后价值。miR-541水平越低，HCC患者的总生存期(OS)越短。RT-PCR检测发现肿瘤组织中miR-541的表达显著降低。HCC样本中低水平的miR-541也与HCC患者较短的OS相关。低miR-541表达组的复发率明显高于高miR-541表达组(48.4% vs 27.2%， p=0.029)。结果表明miR-541的表达在临床上与癌症复发和患者预后相关。

　　2. 在体内外，miR-541抑制肝癌细胞HCC的恶性表型

　　过表达miR-541可显著抑制体外HCC细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭。相反，抑制miR-541会增加HCC细胞的恶性表型。此外，Ad-miR-541(过表达miR-541的腺病毒)组的移植瘤小鼠肿瘤生长和肿瘤重量显著降低。细胞移植4周后的体外成像显示，Ad-Max组老鼠在5只（共9只）小鼠骨头中检测到荧光，但是Ad-miR-541组在2只（共9只）小鼠骨头中检测到荧光。在Ad-Max组的9只小鼠中有3只在肺中检测到荧光素酶信号，而在Ad-miR-541组的10只小鼠中只有1只检测到荧光素酶信号。组织学分析证实Ad-miR-541组在骨骼和肺部有较小的肿瘤病灶。这些数据表明miR-541在HCC中具有强大的肿瘤抑制作用。

　　3. 在体内外，miR-541抑制肝癌细胞自噬

　　LC3 I转变为LC3 II是自噬的一个标志。P62是自噬通量被抑制时细胞内积累的自噬受体。miR-541过表达降低了HCC细胞中LC3 II的水平，增强了P62的水平。相反，抑制miR-541可增加HCC细胞中LC3 II的水平，降低P62的表达。免疫化学染色显示， Ad-miR-541处理的皮下异种移植中，LC3阳性肿瘤细胞较少，P62阳性肿瘤细胞较多。TEM显示Ad-miR-541减少了肝癌细胞的自噬小体数量。使用mRFP-GFP-LC3报告基因构建的活细胞成像显示，自噬通量的比率在miR-541过表达时显著受到抑制，而在miR-541过表达时增强。

　　4. ATG2A和RAB1B是miR-541的两个直接靶点

　　Targetscan, miRDB, microRNA.org, DIANA-microT, TARGETMINER和RNA22,暗示miRNA-541和ATG2A,RAB1B之间的相互作用，这些是自噬功能重要的调控作用。在过表达miRNA-541的肝癌细胞中，ATG2A 和RAB1B 的mRNAs和蛋白水平降低。miRNA-541抑制剂增加其表达。ATG2A mRNA 3’UTR中mir-541的两个结合位点和RAB1B mRNA 3’UTR中miR-541的四个潜在结合位点。荧光素酶标记实验显示ATG2A和RAB1B 3’ UTR是miR-541的直接靶标。此外，WB和IHC发现，在人类肝癌样本中，miR-541水平的增加伴随着ATG2A和RAB1B蛋白质表达减少。并且ATG2A和RAB1B的水平与miR-541水平负相关。

　　5.在肝癌细胞HCC中，ATG2A和RAB1B促进癌症和自噬

　　生存曲线显示ATG2A和RAB1B mRNAs的高表达与较差的预后相关，这与miR-541的临床意义相反。siATG2A和 siRAB1B抑制增殖，集落形成，肝癌细胞的迁移和入侵。此外，siATG2A和siRAB1B降低 LC3 II的水平，增加了肝癌细胞中P62表达和阻止自噬小体合成。这些结果表明ATG2A和RAB1B是肝癌细胞自噬的癌基因和阳性调节因子。

　　6. miR-541通过下调ATG2A和RAB1B抑制HCC的进展和自噬

　　在转染siATA2A和siRAB1B的细胞中，miR-541抑制剂增加HCC细胞的增殖、迁移和侵袭的作用显著降低。miR - 541抑制剂在促进自噬中的作用也被siATG2A和siRAB1B逆转了。总的来说，ATG2A和RAB1B的下调至少在一定程度上有助于影响miR-541在肝癌细胞中的作用。

　　7.在体内外，miR-541增强索拉非尼诱导的肝癌细胞死亡

　　自噬加重索拉非尼耐药。Kaplan-Meier生存分析显示，高miR-541水平的HCC患者受益于索拉非尼治疗，而低miR-541表达的患者则不受益。此外，转染miR-541 mimic的HCC细胞比对照细胞对索拉非尼更敏感，而转染miR-541 inhibitor的细胞对索拉非尼更耐药（IC50结果）。Ad-miR-541和索拉非尼都抑制了肿瘤的生长、体积和重量。IHC染色显示， Ad-miR-541或索拉非尼处理的肿瘤中Ki-67阳性细胞数量减少，而Ad-miR-541和索拉非尼联合处理的肿瘤中Ki-67水平进一步降低。此外， Ad-miR-541或Ad-miR-541联合索拉非尼治疗可导致ATG2A和RAB1B表达明显下降，而索拉非尼治疗可导致ATG2A和RAB1B表达升高。总的来说，索拉非尼对HCC生长的抑制作用可通过miR-541增强，这至少部分归因于其对ATG2A和RAB1B表达的调控作用。

　　总结：

　　研究强调了miR-541在HCC中的生物学意义，并阐明了其在HCC病程中的分子机制。研究为HCC的个体化治疗提供了三个新的治疗靶点和预后标记。本研究的结果将有益于肝癌的治疗。如有需要，请咨询康必行海外医疗医学顾问：4006-130-650或扫码添加下方微信，我们将竭诚为您服务！

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