肝癌是癌症相关死亡的主要原因之一。肝细胞癌（HCC）约占所有肝脏恶性肿瘤的85-90%。HCC中最常见的致癌突变目前尚不清楚。肝癌常见靶向治疗药物包括仑伐替尼、索拉非尼、瑞戈非尼、阿帕替尼及贝伐珠单抗等。仑伐替尼是一种口服多激酶抑制剂，主要抑制VEGFR1-VEGFR3、FGFR1–FGFR4、PDGFRα、KIT和RET。然而作为一线治疗药物，仑伐替尼的总有效率也仅为24.1%，仍需探究更为有效的联合疗法，以期改善仑伐替尼的疗效。

　　1.抑制EGFR提高肝癌对仑伐替尼敏感性

　　研究者发现，与仑伐替尼有限的临床疗效一致，克隆形成试验提示大多数肝癌细胞对仑伐替尼天然耐药。进一步通过基于靶向激酶组的CRISPR-Cas9基因编辑文库高通量功能筛选系统发现，敲除表皮生长因子受体（EGFR）可提高肝癌细胞对仑伐替尼的药物敏感性。为了进一步验证这一现象，研究者采用shRNA技术敲低SNU449细胞中EGFR，并检测敲低后的SNU449对仑伐替尼的敏感性。同样发现，敲低SNU449细胞中EGFR，可显著提高SNU449细胞对仑伐替尼的敏感性，证实抑制EGFR与仑伐替尼联用对肝癌细胞具有合成致死作用。

　　2.仑伐替尼与EGFR的相互作用

　　与人肝细胞系HepaRG相比，大多数肝癌细胞系EGFR呈高表达,实验中发现，只有EGFR高表达细胞系显示仑伐替尼和EGFR小分子抑制剂（吉非替尼或厄洛替尼）之间存在协同作用，而EGFR低表达细胞系中则未出现协同作用。已有的临床试验表明厄洛替尼和索拉非尼的组合没有带来显著的临床获益。研究者还发现吉非替尼和索拉非尼无论在EGFR低或EGFR高表达的肝癌细胞系中均没有协同作用。分析原因，仑伐替尼和索拉非尼之间的一个显著差异是仑伐替尼可抑制成纤维细胞生长因子受体（FGFR）信号传导。研究者发现以上肝癌细胞系对两种选择性FGFR抑制剂（AZD4547和BGJ398）的敏感性与仑伐替尼相似，同样EGFR抑制剂也增强了EGFR高表达肝癌细胞对FGFR抑制剂的敏感性。这些结果表明，仑伐替尼可能主要通过抑制FGFR信号来与EGFR抑制剂协同抑制肝癌细胞。仑伐替尼治疗增加了所有四种EGFR高表达肝癌细胞系中EGFR的Tyr1068磷酸化水平，这表明仑伐替尼可激活EGFR。仑伐替尼和EGFR抑制剂的组合抑制了这种反馈激活，进一步发现在EGFR高表达细胞中，仑伐替尼对ERK1和ERK2（ERK1/2）的磷酸化产生了更完全的抑制，但在EGFR低细胞中却没有。动物实验表明，仑伐替尼和吉非替尼的组合协同抑制了SNU449和Huh6异种移植瘤生长，而单药治疗效果甚微。免疫组化提示增殖标志物（PCNA和Ki-67）和微血管密度指标CD31降低，凋亡标志物cleavedcaspase-3增加。接下来，研究者采用HCC患者来源的肝癌细胞构建了异种移植小鼠模型（PDX），并用仑伐替尼、吉非替尼及其组合模式治疗小鼠，其中PDX1和PDX2高表达EGFR（组织化学评分（H-SCORE）＞200），而PDX3和PDX4低表达EGFR（H-SCORE<200）。结果显示，仑伐替尼联合吉非替尼在EGFR高表达的PDX模型中获得了较高的抑瘤率。而在EGFR低表达的PDX3和PDX4模型协同抑瘤作用较弱。并且，对于EGFR缺失的PDX4，仑伐替尼单药治疗即取得较好抑瘤率。

　　3.仑伐替尼激活EGFR–PAK2–ERK5通路

　　基于CRISPR生存力评分分析发现，PAK2和ERK5（也称为MAPK7）亦参与调控SNU449细胞对仑伐替尼的敏感性。因此，EGFR–PAK2–ERK5途径的激活可能是仑伐替尼存在下肝癌细胞存活的保护机制。研究者进一步证明，仑伐替尼可以上调磷酸化PAK2和磷酸化ERK5的水平。而联合EGFR抑制剂则有效地抑制了该通路的激活，也导致了MEK和ERK磷酸化的抑制。既往研究表明，ERK1/2抑制可导致EGFR的激活。研究者同样观察到仑伐替尼可引起ERK1/2的急性抑制，这可能解释了EGFR和下游信号的激活。为了进一步证实EGFR–PAK2–ERK5对仑伐替尼敏感性的影响，研究者用PAK抑制剂和仑伐替尼来治疗肝癌细胞。这种组合有效阻止了ERK5的激活，并导致MEK和ERK磷酸化的抑制，表明PAK2作用于ERK5和ERK1/2的上游。为了进一步研究ERK5激活在仑伐替尼治疗中的作用，研究者将仑伐替尼与ERK5选择性抑制剂XMD8-92组合或使用ERK5的基因敲除，结果显示仑伐替尼和ERK5抑制剂组合可抑制ERK5和ERK1/2，并抑制增殖。然而，当与仑伐替尼联合使用时，ERK5抑制剂表现出比PAK抑制剂更弱的作用。ERK5的基因敲除也提高了肝癌细胞对仑伐替尼的敏感性。肿瘤切片的免疫组织化学分析进一步揭示了用仑伐替尼和吉非替尼治疗的小鼠肿瘤中EGFR–PAK2–ERK5和ERK1/2信号的下调。

　　4.临床中联合治疗的疗效

　　研究者采用免疫组化检测了298个HCC样本的EGFR表达。根据H-SCORE结果，其中52.6%的病例存在EGFR高表达。结合以上临床前研究结果，研究者在上海仁济医院开展了注册号为NCT04642547的临床研究，以探讨在含仑伐替尼方案治疗失败的不可切除肝癌患者中仑伐替尼联合吉非替尼的疗效和安全性。截止投稿，已有12例患者接受了仑伐替尼联合吉非替尼治疗并完成病情评估。12名患者中有4名疗效评估为部分缓解，4名病情稳定，4名在联合治疗4-8周后出现疾病进展。其中患者A在采用仑伐替尼联合吉非替尼治疗约4周复查MRI图像显示，肿瘤缩小76.5%，达到部分缓解。同样，患者C在仑伐替尼和吉非替尼联合治疗4周后，MRI评估肿瘤负荷减轻，其中一个主要靶病变在影像学中消失，血清AFP水平进一步降低。其中患者E的大多数病灶在联合治疗后得到有效控制。然而，治疗过程中出现了新的病变，由于新的病灶的出现，该患者的疗效被评为进展。基于以上临床数据，提示EGFR高表达的HCC肿瘤患者可能从仑伐替尼与EGFR抑制剂的联合治疗模式中获益。

　　研究结果

　　该研究发现，无论体外还是体内实验，EGFR抑制剂和仑伐替尼的组合在高表达EGFR的肝癌细胞及肝癌移植瘤模型中均表现出协同抑制作用，即导致合成致死。机制研究发现，仑伐替尼对FGFR的抑制会导致EGFR–PAK2–ERK5信号轴的反馈激活，反馈激活的信号会促进肿瘤的存活，而采用EGFR抑制剂会阻断该信号，从而解释了两者联用的协同作用机理。研究者开展的一项临床研究亦证实EGFR抑制剂吉非替尼联合仑伐替尼对既往仑伐替尼治疗进展的EGFR高表达HCC患者的有效性。

　　对于肝癌，可供选择的治疗药物仍然非常有限，而且大多疗效欠佳，亟待研究发现新的有效治疗药物或联合治疗模式，以提高疗效。本研究揭示EGFR抑制剂联合仑伐替尼对高表达EGFR的肝癌细胞可导致合成致死，相关机制及临床研究为EGFR抑制剂联合仑伐替尼在EGFR高表达的这一肝癌群体中的应用提供了重要的基础和临床数据。如有需要，请咨询康必行海外医疗医学顾问：4006-130-650或扫码添加下方微信，我们将竭诚为您服务！点击拓展阅读：仑伐替尼/乐伐替尼(LENVATINIB)+TACE是晚期肝癌一线治疗的新方案？

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