摘要：

　　一种新的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)， 奥西替尼，对EGFR突变的肺癌患者有显著的疗效。然而，一些患者表现出固有的耐药性和对奥西替尼的应答不好。本研究表明，奥西替尼通过抑制一个负反馈循环来激活AXL.激活的AXL与EGFR和HER3在维持细胞存活和诱导对奥西替尼耐药细胞的出现有关。AXL抑制降低了暴露于奥西替尼的过表达AXL的EGFR突变肺癌细胞生存能力。与单独使用奥西替尼相比，在初始或耐药期添加AXL抑制剂可减小肿瘤大小并延缓肿瘤的再生长。AXL在EGFR突变肺癌的临床标本中高表达，其高表达与EGFR-TKI的低应答率有关。这些结果表明，AXL在奥西替尼的原发耐药和耐奥西替尼细胞中具有关键作用。

　　引言：

　　AXL是一种酪氨酸激酶受体，1991年首次在两名慢性髓系白血病患者中发现。据报道，肿瘤中AXL蛋白的高表达与恶性胶质瘤、乳腺癌、肺癌和急性髓系白血病患者的预后不良有关。与EGFR野生NSCLC相比，AXL过表达在EGFR激活突变的肺腺癌中更为常见。此外，几项研究报道，肿瘤中AXL信号的激活与几种靶向分子治疗药物和化疗药物的获得性耐药有关。然而，其在特定靶向分子治疗药物的原发耐药和超耐药细胞中的作用仍不清楚。

　　本研究旨在阐明EGFR突变的NSCLC细胞对奥西替尼耐药的分子机制，包括AXL信号在起始和耐药阶段的作用。我们确定AXL与包括EGFR和HER3在内的其他分子相互作用，维持了暴露于奥西替尼的肿瘤细胞的生存。在肿瘤细胞来源的移植瘤(CDX)模型和病人来源的移植瘤(PDX)模型中使用特定的siRNA或化合物来抑制AXL,可降低暴露于奥西替尼的肿瘤细胞的活力，抑制超细胞的出现，并延缓肿瘤的复发。

　　AXL信号通路图（Ross A Okimoto,et al. LungCancer (Auckl). 2015; 6: 27–34.）。AXL(Anexelekto；Greek for "uncontrolled"希腊语意思是“不受控”)是一种进化晚期才出现的受体型酪氨酸激酶。最近发现其过度表达可介导肿瘤化疗产生的多种耐药性，但具体的分子机制还不明确。AXL与配体GAS6结合可激活AXL的酪氨酸激酶活性，激活下游信号转导通路。参与细胞黏附与识别、细胞增殖、抗凋亡、凝 血、炎症反应等过程。AXL基因异常表达在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，包括阻止肿瘤细胞凋亡，参与肿瘤性血管生成及侵袭等病理过程。

　　结果：

　　奥西替尼激活AXL,重新激活HER3和EGFR

　　EGFR突变的NSCLC细胞，包括PC-9细胞，对第三代EGFR-TKI 奥西替尼高度敏感。病人口服80mg奥西替尼后血浆药物浓度Cmax 635.4 nM,我们认为1μM或更低点是奥西替尼临床相关的浓度。然而， 即使在高浓度(1μM) 奥西替尼治疗72 小时，大约有20-30%PC-9细胞存活。以确定这些细胞逃脱奥西替尼抑制的机制，我们使用一个磷酸激酶抗体阵列评估奥西替尼治疗或不治疗 72 小时后PC-9细胞中磷酸激酶。我们发现一些分子，如HER3、MET和AXL的磷酸化在奥西替尼治疗后增加。因此，我们推测对奥西替尼的耐药可能是由这些蛋白的生存信号引起的。动力学分析显示，虽然奥西替尼在4小时时显著抑制了EGFR的磷酸化，但在72小时时可以检测到EGFR被重新激活。奥西替尼在4小时时也抑制了HER3和MET的磷酸化，但在24小时时这些蛋白的磷酸化被重新激活，并在72小时时逐渐增加。另一方面，虽然AXL未被组成性磷酸化，但其磷酸化是由奥西替尼在4小时诱导的，并在72小时时增加。ERK是EGFR的下游分子，奥西替尼在4小时时显著抑制了ERK的磷酸化，并持续了72小时。相反，另一个EGFR信号下游分子AKT在4小时时被奥西替尼轻微抑制，并在24小时时被重新激活。这些结果表明，暴露于奥西替尼可能激活了AXL,从而重新激活了PC-9细胞中的HER3、MET和EGFR.

　　AXL与EGFR-TKIs敏感性呈负相关

　　我们还回顾性评估了46例EGFR突变的NSCLC和11例EGFR T790M突变的NSCLC,AXL表达与第一代或第二代EGFR-TKIs和奥西替尼的临床疗效之间的相关性。采用免疫组化(IHC)染色法对EGFR-TKI治疗前的肿瘤样本细胞AXL的表达进行评估，并将AXL分为高(3+)、中(2+)、低(1+)和无(0)表达。在46例EGFR突变的第一代或第二代EGFR-TKI治疗的NSCLC肿瘤标本中，出现高、中、低、无AXL表达分别有12例(26.1%)、8例(17.4%)、23例(50.0%)和3例(6.5%)。在11例EGFR T790M突变奥西替尼治疗的非小细胞肺癌中，分别有3例(27.2%)、1例(18.2%)、7例(63.6%)和0例(0.0%)标本中发现高、中、低和无AXL表达。AXL表达分数为0-2 +患者第一或第二代EGFR-TKIs治疗应答率高(87.5-100%),而对那些表达3 +AXL患者的第一或第二代EGFR-TKIs应答率明显降低(50%)(P < 0.001)。AXL表达评分为0 -2+的患者对奥西替尼的应答率较高(85.7-100%)，而AXL表达评分为3+的患者对奥西替尼的应答率较低(66.7%)。此外，第一代和第二代EGFR-TKIs和奥西替尼治疗后，AXL表达评分为3+的患者与AXL表达评分为0至2+的患者相比，PFS更短(P = 0.168，危险比(HR) = 0.58;P = 0.449和HR = 0.81分别)。这些发现表明，AXL表达与EGFR-TKI治疗(包括奥西替尼)的不良初始应答相关，并与早期复发相关。

　　AXL敲除使表达AXL细胞对奥西替尼敏感

　　AXL抑制剂使表达AXL的细胞对奥西替尼敏感

　　我们评估了AXL抑制剂是否可以增加EGFR突变的NSCLC细胞对EGFR-TKIs的敏感性。AXL抑制剂NPS1034对EGFR突变的NSCLC细胞系的生存能力没有影响。NSP1034与第三代EGFR-TKI 奥西替尼或rociletinib联合使用72小时，可增加细胞对这些EGFR-TKIs的敏感性，并降低高AXL表达的PC-9、PC-9GXR和HCC4011细胞的存活率，我们证明AXL是NPS1034的抑制靶点，使EGFR突变的NSCLC细胞对奥西替尼敏感。

　　奥西替尼联合干扰RNA或 AXL抑制剂NPS1034 在1 小时或72 小时后同样显著抑制了AXL,EGFR,HER3,和AKTD的磷酸化，相比于仅奥西替尼治疗高AXL表达的细胞系。相比之下，低AXL表达细胞系，奥西替尼和NPS1034没有影响AKT蛋白激酶的磷酸化，相比于奥西替尼单药。另一种AXL抑制剂(ASP2215)与奥西替尼联合使用72小时对PC-9和HCC4011细胞也产生了相似的作用相比于单独使用奥西替尼。

　　这些结果清楚地表明，联合使用AXL抑制剂可以增加细胞对奥西替尼的敏感性，主要通过调节AKT活性，从而降低高表达EGFR的非小细胞肺癌细胞系的生存能力。

　　AXL抑制剂阻止了超耐药细胞的出现

　　超耐药(DT)细胞被定义为对靶向药物敏感性显著降低（100倍）的一小群细胞。它们是在接触靶向药物的几天到几周内产生的。由于细胞获得了耐药性，DT细胞被认为是肿瘤复发的基础。因此，我们检测了AXL是否参与了暴露于奥西替尼的DT细胞的出现。先前的一项研究表明，来自暴露于厄洛替尼的PC-9细胞的DT细胞通过IGF-1R（胰岛素生长因子1受体）信号保持其活力。我们发现与亲代PC-9细胞相比，奥西替尼耐药的DT细胞IGF-1R蛋白的表达和磷酸化水平更高。此外，与亲代细胞相比，DT细胞表达了更高水平的EGFR、HER3和AXL.有趣的是，虽然AXL磷酸化增加，但与亲代细胞相比，DT细胞中EGFR和HER3的磷酸化减少，这表明了AXL和IGF-1R的依赖关系。事实上，与亲代细胞相比，DT细胞中与EGFR和HER3相关的AXL蛋白更多。AXL抑制剂(NPS1034)和IGF-1R抑制剂(OSI906)均可明显降低DT细胞的生存能力，而亲代PC-9或HCC4011细胞则无明显降低。NPS1034和OSI906对DT细胞的联合治疗进一步抑制了DT细胞生存能力。免疫印迹分析显示，奥西替尼不能抑制DT细胞的EGFR,HER3,ERK,AXL的磷酸化，NSP1034治疗抑制了AXL,EGFR和HER3的磷酸化从而抑制AKT蛋白激酶的磷酸化，但并不影响的ERK磷酸化。此外，使用奥西替尼联合NPS1034对PC-9、PC-9GXR和HCC4011细胞进行连续治疗，阻止了DT细胞的出现。这些结果表明，除了IGF-1R外，AXL还在奥西替尼的DT细胞出现过程中发挥了关键作用。

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